اساتید راهنما:

دکتر فردین عمیدی

دکتر محمد علی صدیقی گیلانی

استاد مشاور: دکتر اشرف آل یاسین 

نگارنده: مریم شعبانی نشتایی

مقطع دكتري تخصصی PhD رشته بیولوژی تولید مثل 

عنوان: بررسی اثر پروتئین کیناز فعال شونده بوسیله آدنوزین منو فسفات (AMPK) بر روی کیفیت اسپرم افراد normozoospermia در طی فرایند انجماد– ذوب

مقدمه: تغییرات بیوشیمیایی و فیزیکی در طول فرایند انجماد و ذوب، بر روی عملکرد­های وابسته به انرژی اسپرم که برای لقاح مورد نیاز می­باشند، اثر منفی می­گذارند. AMPK، یک سرین/ ترئونین کیناز فعال شونده بوسیله AMP که بعنوان یک گیرنده کلیدی وضعیت انرژی سلولی و تنظیم کننده متابولیسم سلولی عمل می­کند، در جریان استرس متابولیکی، نقش کلیدی در بقا سلولی و ارگانیسم از طریق حفظ هموستاز متابولیکی ایفا می­کند و بنابراین، می­تواند به عنوان مولکول کلیدی در تطابق اسپرم طی فرایند انجماد- ذوب عمل کند. از آنجاکه فعالیت AMPK در شرایط مختلف انرژی متفاوت است، این مطالعه با هدف بررسی بیان و محل قرارگیری داخل سلولی این پروتئین در اسپرماتوزوآی انسانی و تعیین نقش احتمالی آن در تنظیم پارامترهای عملکردی اسپرم شامل حرکت، بقای سلولی، سطح گونه­های واکنشی اکسیژن (reactive oxygen species: ROS)، پتانسیل غشای میتوکندری، فراگمانتاسیون DNA و نیز بيان ژن­هاي مرتبط با كيفيت اسپرم (PRM1 و PRM2) و موفقيت بارداري (ADD1) بدنبال فرایند انجماد- ذوب در افراد نرموزواسپرم (دارای اسپرم طبیعی) صورت گرفت. 

مواد و روش‌ها: 22نمونه­ نرموزواسپرم در حضور یا غیاب غلظت­های مختلف مهار کننده [Compound C (CC): 1, 10, 30 µM] یا فعال کننده [resveratrol (RSV): 5, 15, 25 µM]  AMPK در زمان­های مختلف (30 دقیقه و یک ساعت) در 37 درجه سانتی­گراد انکوبه و سپس منجمد شدند.بیان AMPK و سطح فسفوریلاسیون (فعالیت) آن با روش وسترن بلات و محل قرارگیری داخل سلولی آن با ایمونوسیتوشیمی ارزیابی گردید. ویژگی­های حرکتی و بقای اسپرم به ترتیب با استفاده از روش CASA (computer-assisted sperm analyser) و رنگ آمیزی ائوزین- نگروزین بررسی شدند. کیت­های JC-1 و TUNEL و نیز روش real-tim PCR به ترتیب برای ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری، فراگمانتاسیون DNA و بيان ژن­هاي مرتبط با كيفيت و موفقيت بارداري اسپرم مورد استفاده قرار گرفتند.

نتایج: AMPK اساسا در کل فلاژلوم و ناحیه پشت آکروزومی سر اسپرم انسانی (post-equatorial region) بیان می­شود. وضعیت فسفوریلاسیون AMPK نیز با استفاده از روش وسترن بلات تایید گردید که به طور مؤثری توسط CC مهار و توسط RSV افزایش یافت. علاوه بر این، RSV به طور معنی­داری سطح ROS (O2•− and H2O2) و فراگمانتاسیون DNA را کاهش و سطح بيان ژن­هاي  مرتبط با كيفيت (PRM1 و PRM2) و موفقيت بارداري (ADD1) اسپرم و نیز پتانسیل غشای میتوکندری را بدنبال فرایند انجماد- ذوب افزایش داد. با این وجود، RSV قادر به بازگرداندن اثرات مخرب انجماد بر پارامترهای زنده­مانی و تحرک اسپرم نبوده است. در مقابل، CC اثر مخالف با RSV بر فسفوریلاسیون AMPK، سطح ROS داخل سلولی، فراگمانتاسیون DNA، پتانسیل غشای میتوکندری، پارامترهای تحرک و بیان ژن­هاي PRM1 ، PRM2 وADD1  نشان داد.   

نتیجه‌گیری: این مطالعه اثرات متفاوت تعدیل­کننده­های AMPK (CC / RSV) بر فرآیندهای حیاتی اسپرم مانند تحرک، آپوپتوز، استرس اكسيداتيو، پتانسیل غشای میتوکندری و بيان ژن­هاي مرتبط با كيفيت اسپرم (PRM1 و PRM2) و موفقيت بارداري (ADD1) که در نتیجه فرایند انجماد و ذوب دچار تغییر می شوند را نشان می دهد که بیانگر اهمیت فعالیت AMPK در عملکرد نهایی اسپرم انسانی، لقاح، می­باشد.

واژگان کلیدی: AMPK، انجماد؛ اسپرم انسانی؛ گونه­های واکنشی اکسیژن؛ پتانسیل غشای میتوکندری؛ فراگمانتاسیون DNA؛ mRNA

 

Abstract

Evaluation of the effects of adenosine monophosphate-activated kinase, AMPK, on sperm quality of normozoospermic men during freezing- thaweing

Introduction: Biochemical and physical modifications during the freeze-thaw process adversely influence the restoration of sperm energy-dependent functions required for fertilization. Adenosine activated protein kinase, AMPK, is a cell energy sensor and regulator of cell metabolism that has not been yet assessed in human spermatozoa. As AMPK activity differs in various energy conditions our aim, thus, was to investigate the expression and intracellular localization of AMPK protein and its possible role in regulating post- thaw functioning of human spermatozoa. 

 

Materials and Methods: Semen samples from 22 normozoospermic men were incubated in the presence or absence of different concentrations of AMPK inhibitor, Compound C (CC) (1, 10, and 30 µM) or AMPK activator, resveratrol (RSV) (5, 15, 25 µM) for different lengths of time (30 minutes and 1 hour) and were then cryopreserved.

 

Results: AMPK is expressed essentially in the entire flagellum and the post-equatorial region of the head. AMPK phosphorylation status was confirmed using western blot which is effectively blocked or increased by CC and RSV in human spermatozoa, respectively. Furthermore, RSV significantly decreased ROS and DNA fragmentation and induced overexpression of PRM1, PRM2 and ADD1 and increase of mitochondrial membrane potential in frozen-thawed spermatozoa. Nevertheless, it was not able to restore the deleterious effects of freezing on viability and motility parameters. In contrast, CC showed opposite effects to RSV on AMPK phosphorylation, ROS, DNA fragmentation, mitochondrial membrane potential, motility parameters and PRM1, PRM2 and ADD1 mRNA levels.

 

Conclusion: This study highlights the differential effects of AMPK modulators (CC/RSV) on crucial sperm processes such as motility, intracellular ROS, apoptosis, oxidative stress and which can be altered upon freeze-thaw process, indicating the importance of AMPK activity for human sperm functions to accomplish their ultimate role of fertilization.

Keywords:Spermatogonial stem cell, Cryopreservation, Catalase, Alpha-tocopherol, Transplantation.