آموزش تحصیلات تکمیلی علوم پایه دانشکده  

استاد راهنما: دکتر عباس بهادر

استاد مشاور: دکتر علیرضا اکرامی

نگارنده: محمد سواری

مقطع: دکتری تخصصی PhD رشته باکتری شناسی پزشکی

عنوان پژوهش: جستجوی مخازن ژنهای مقاومت به دارو در ترانسپوزونهای گروهTnAbaR و پلازمیدهای R و بررسی اثر  ژنهای adeRS و baeSRبر بیان ایفلاکس پمپ AdeABCدر ایزوله های کلینیکی اسینتوباکتر بومانی با حساسیت کاهش یافته نسبت به Tigecycline

چكيده

مقدمه و هدف:ظهور سویه های اسینتوباکتر بومانی با حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سیکلین، اخیرا تبدیل به یکی از معضلات درمانی شده است. چنین سویه هایی تقریبا به سایر آنتی بیوتیکهای متداول نیز مقاومت نشان می دهند که علت این مسئله اکتساب سریع مخازنی از ژنهای مقاومت در ساختارهای ژنومی شامل AbaR ها و پلازمیدهای R هستند. حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سکلین با افزایش بیان یک ایفلاکس پمپ به نام AdeABC مرتبط است. این ایفلاکس پمپ توسط یک سیستم تنظیمی دو جزئی به نام AdeRS تنظیم می گردد. اخیرا سیستم دو جزئی دیگری به نام BaeSR را نیز در این امر دخیل دانسته اند. هدف از این مطالعه جستجوی مخازن ژنهای مقاومت به دارو در ترانسپوزونهای گروه TnAbaR و پلازمیدهای R و بررسی اثر ژنهای adeRSو baeSR بر بیان ایفلاکس پمپ AdeABC در ایزوله های کلینیکی اسینتوباکتر بومانی با حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سیکلین است.

روش کار: صد و بیست ایزوله اسینتوباکتر بومانی جدا شده از بیماران دچار سوختگی، از نظر حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سیکلین مورد ارزیابی قرار گرفتند و سپس حداقل غلظت ممانعت کننده از رشد (MIC) سویه های با حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سیکلین نسبت به کولسیتین، ایمیپنم و مروپنم تعیین گردید. الگوی مقاومتی این ایزوله ها نسبت به 17 آنتی بیوتیک دیگر مورد ارزیابی قرار گرفت و ایزوله ها از نظر اپیدمیولوژی مولکولی به روشهای IC typing، MLVA typing و plasmid profiling مورد بررسی قرار گرفتند. با استفاده از روش PCR وجود 29 ژن مقاومت به آنتی بیوتیک روی ساختارهای کروموزومی AbaR و پلازمیدهای R مورد جستجو قرار گرفت و ایزوله ها AbaR mapping شدند. با استفاده از روش Real time PCR میزان بیان ژن adeB در این ایزوله ها بررسی و با ایزوله حساس مقایسه شد. همچنین میزان بیان ژنهای adeRS و baeSR و نیز توالی آنها در این ایزوله ها در مقایسه با ایزوله حساس، مورد ارزیابی قرار گرفت.

یافته ها: 40.8% درصد از ایزوله های مورد مطالعه، حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سیکلین را نشان دادند. کلون GC1 شایعترین کلون و بعد از آن G9 شایعترین SG موجود بود. ایزوله ها در 40، MLVA type مختلف، 13 کلاستر و 33 singleton قرار گرفتند و هر کدام دارای 3 تا 5 پلازمید و همه آنها در یک پلازمید حدودا 10kb مشترک بودند. ژنهای مرتبط با مقاومت دارویی بین AbaR ها و R پلازمیدها توزیع شده بودند. تمام ایزوله های این مطالعه دارای واریانتهای جدیدی از AbaR بودند. ژنهای adeB، adeS، adeR، baeS و baeR در همه ایزوله های با حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سیکلین در مقایسه با سویه حساس (رفرنس) دچار افزایش بیان شده بود. توالی یابی ژنهای adeS، adeR، baeS و baeR در سویه های با حساسیت کاهش یافته نسبت به تیجی سیکلین در مقایسه با سویه رفرنس، نشان داد که همه آنها دچار تعویضهای متعدد آمینو اسیدی شده اند.

نتیجه گیری: اکثر سویه های اسینتوباکتر بومانی با حساسیت کاهش یافته نسبت یه تیجی سیکلین مخازن ژنهای مقاومت را هم در AbaR ها و هم در R پلازمیدها ذخیره می کنند. هر دو سیستم دوجزئی AdeRS و BaeSR در ایزوله های اسینتوباکتر بومانی با حسایت کاهش بافته نسبت به تیجی سیکلین دچار overexpression شده اند.

کلمات کلیدی: اسینتوباکتر بومانی، تیجی سیکلین، AbaR، R plasmid، ایفلاکس پمپ AdeABC، سیستم دو جزئی AdeRS، سیستم دو جزئی BaeSR

Abstract:

Detecttion of drug resistance genes reserviores in TnAbaRs and R plasmids and study of adeRS and baeRS regulatory systems on AdeABC efflux pump among Acinetobacter baumannii clinical isolates with decreased susceptibility to tigecycline

Background: The Rise of A. baumannii strains with decreased susceptibility to tigecycline, recently became one of the complications of treatment. Such strains are also resistant to almost all other conventional antibiotics because of rapid acquisition of resistance genes reservoirs in genomic structures including AbaR and R plasmids. Decreased susceptibility to tigecycline is associated with increased expression of an efflux pump called AdeABC. This efflux pump be regulated by a two-component regulatory system named AdeRS. Recently, another two-component system; BaeRS also has been implicated in this affair. The aim of this study was to detecttion of drug resistance genes reserviores in TnAbaRs and R plasmids and study of AdeRS and BaeRS regulatory systems on AdeABC efflux pump among Acinetobacter baumannii clinical isolates with decreased susceptibility to tigecycline.

Materials and methods: One hundred and twenty isolates of A. baumannii isolated from burn patients, were tested for decreased susceptibility to tigecycline and then the minimum inhibitory concentration (MIC) of such isolates were determined against colistin, imipenem and meropenem. The antibiotics resistance patterns of these isolates then measured against 17 antibiotics and tested in terms of molecular epidemiology by IC typing, MLVA typing and plasmid profiling. By using PCR, more than 20 antibiotics resistance genes were tested in term of chromosomal location on AbaRs or R plasmids and the isolates were AbaR mapped. By using Real time PCR, adeB gene expression was evaluated in isolates with decreased susceptibility to tigecycline and were compared with a sensitive strain. The expression levels of adeRS and baeSR genes and their sequence in isolates with decreased susceptibility to tigecycline was evaluated and compared with a sensitive strains.

Results: 40.8% of the studied isolates showed decreased susceptibility to tigecycline. GC2 clone was the most common clone and among the SGs; G9 was most frequent one. Isolates were clasified in 40 MLVA type, 4 clusters and 33 singleton and each of these isolates horbored 3 to 5 plasmid and they all were common in a 10kb plasmid. Genes associated with drug resistance were distributed between AbaR and R plasmid. All the isolates in this study were horboring new variants of AbaR. The adeB, adeS, adeR, baeS and baeR genes were overexpressed, in all isolates with decreased susceptibility to tigecycline in compare with the sensitive strain (reference). Sequencing of adeS, adeR, baeS and baeR genes in isolates with decreased susceptibility in compare to the reference strains revealed that all of them suffered multiple amino acid substitutions.

Conclusion: The majority of A. baumannii isolates with decreased susceptibility to tigecycline reserve the resistance gene reservoirs in AbaR and R plasmid. Both AdeRS and BaeSR two components systems in A. baumannii isolates with decreased susceptibility to tigecycline were overexpressed.

Keywords: Acinetobacter baumannii, Tigecycline, AbaR, R plasmid, AdeABCefflux pumps, AdeSR two components system, BaeSR two components system