اساتید راهنما:

دکتر پریچهر پاسبخش

دکتر ایرج راگردی کاشانی

استاد مشاور:دکتر سید نورالدین نعمت­ اللهی ماهانی

نگارنده: فاطمه مغنی قرقی

مقطع درجه دکتری تخصصی (PhD) علوم تشریح 

عنوان پژوهش :اثر کلسی­تونین بر بیانHB-EGF در رحم موش­های نامادری بدنبال انتقال بلاستوسیست­ های تیمار شده با ملاتونین

چكيده

مقدمه و هدف: نقص در لانه­گزینی هنوز یکی از موانع در مسیر تکنیک­های کمک باروری می­باشد. برای موفقیت در امر لانه­گزینی، حضوریک جنین خوب تکامل یافته و اندومتر پذیرنده ضروری می­باشد. کلسیتونین یکی از فا­کتورهایی است که در پذیرندگی رحم و لانه­گزینی جنین نقش مهمی دارد. به علاوه ملاتونین نیز می­تواند کیفیت جنین را ارتقاء داده و لانه­گزینی جنین را بهبود ببخشد. بنابراین در این پژوهش برای ارتقاء کیفیت جنین و پذیرندگی رحم، اثر تیمار بلاستوسیست با ملاتونین همراه با تجویز کلسیتونین بر بیان HB-EGF در رحم موش­های نامادری مورد بررسی قرار گرفت.

روش کار: ابتدا جنین­های دوسلولی از لوله رحم موش باردار 5/1 روزه نژاد NMRI جمع­آوری شده و در محیط کشت GTMحاوی ملاتونین و یا فاقد ملاتونین تا مرحله بلاستوسیست کشت داده شدند. سپس دو واحد کلسیتونین به صورت داخل صفاقی به موش­های مادری و نامادری تزریق شد. 24 ساعت پس از تزریق کلسیتونین بلاستوسیست­های کشت داده شده به رحم موش­های نامادری انتقال داده شدند. دو روز پس از انتقال جنین­ها، موش­ها کشته شده و مناطق لانه­گزینی در رحم موش­های نامادری مشاهده و شمارش شدند. همچنین سطح ژن و پروتئین HB-EGF و گیرنده کلسیتونین در رحم موش­های مادری و نامادری به ­ترتیب بوسیله تکنیک­های Real time-PCR و وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بدست آمده در گروه­های مختلف با استفاده از نرم افزار SPSS-16 و آزمون­ One-Way ANOVA و تست­های Tukey & Tamhane’sT2 post hoc مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. تمامی داده­ها به صورت Mean±SD بیان گردید. و P Value کمتر از 05/0 به لحاظ آماری معنی­دار در نظر گرفته شد.

یافته­ها: نتایج نشان داد که تیمار بلاستوسیست­ها با ملاتونین همراه با تزریق کلسیتونین توانست به میزان معنی­داری بیان ژن و پروتئین HB-EGF را در اندومتر موش­های نامادری در مقایسه با گروه کنترل افزایش دهد. همچنین تجویز کلسیتونین به موش­های مادری نیز بیان ژن و پروتئین HB-EGF را در اندومتر در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی­داری افزایش داد( به ترتیب 01/0≥P و 001/0≥P برای ژن و پروتئین).

در مقایسه با گروه کنترل (5/0±6/2)، میانگین مناطق لانه­گزینی در گروه­های تیمار شده با ملاتونین (5/0±6/4) و دریافت کننده کلسیتونین (1±7) به میزان معنی­داری افزایش یافت ( به ترتیب 05/0≥P و 001/0≥P). همچنین افزایش معنی­داری نیز در مناطق لانه­گزینی در گروه ترکیبی ملاتونین و کلسیتونین مشاهده شد (5/0±6/8، 001/0≥P).

به علاوه کلسیتونین به طور معنی­داری توانست بیان ژن (001/0≥P) و پروتئین (01/0≥P) گیرنده کلسیتونین را در رحم موش­های مادری و نامادری افزایش دهد.

نتیجه گیری: تیمار بلاستوسیست­ها با ملاتونین همراه با تجویز کلسیتونین، می­تواند بیان HB-EGF را در رحم موش­های نامادری افزایش دهد. به علاوه کلسیتونین به تنهایی نیز می­تواند بیان HB-EGF را در رحم موش­های مادری افزایش دهد. همچنین بیان گیرنده کلسیتونین در رحم موش­های مادری و نامادری پس از تزریق کلسیتونین افزایش می­یابد.

 

کلمات کلیدی: بلاستوسیست؛ ملاتونین؛ کلسیتونین؛ HB-EGF؛ لانه­گزینی

 

Abstract

Effect of calcitonin on HB-EGF expression in the uterine of pseudo-pregnant mice following transfer of melatonin pretreated blastocysts

Objective: Implantation failure is an obstacle in assisted reproduction techniques. A well developed embryo and receptive endometrium are essential for successful implantation. Calcitonin is one of the molecules involved in uterine receptivity and embryo implantation. Moreover melatonin can promote embryo quality and improve implantation. So, to improve embryo quality and endometrial receptivity, in this study we examined the effect of pretreatment of blastocyst with melatonin along with calcitonin administration on HB-EGF expression in pseudo-pregnant mice.

Materials and Methods: Two cell stage embryos were collected from the oviduct of 1.5 day pregnant NMRI mice and cultured to blastocyst stage in GTM medium with or without 10-9M melatonin. 2 IU calcitonin was injected Intra peritoneally into pregnant and pseudo-pregnant mice. Twenty four hours after calcitonin injection, cultured blastocysts were transferred into the uterine of pseudo-pregnant mice. Two days after embryo transfer, implantation sites were counted in the uterine of pseudo-pregnant mice and the level of HB-EGF mRNA and protein in the uterine of naturally pregnant and pseudo-pregnant mice was evaluated by quantitative RT- PCR and western blot. Statistical analysis was made by Independent-samples T-test and One-Way ANOVA followed by Tukey’s and Tamhane’s post hoc tests. A value of p

Results: The results showed that melatonin pretreatment of blastocyst along with calcitonin administration significantly increased HB-EGF mRNA (p≤0.01) and protein (p≤0.001) in the endometrium of pseudo-pregnant mice. Also administration of calcitonin in naturally pregnant mice significantly increased HB-EGF mRNA (p≤0.01) and protein (p≤0.001) in endometrium. Compared with control group (2.6± 0.5), the average number of implantation sites in the melatonin group (4.6± 0.5) and calcitonin group (7± 1) significantly increased (p≤0.05 and p≤0.001 respectively). There was a significant increase in implantation sites in melatonin and calcitonin combination group (8.6± 0.5, p≤0.001).

Moreover calcitonin significantly enhanced calcitonin receptor mRNA (p≤0.001) and protein (p≤0.01) in uterine of naturally pregnant and pseudo-pregnant mice.

Conclusion: In conclusion, melatonin pretreated blastocyst along with calcitonin can increase HB-EGF expression in uterine of pseudo-pregnant mice. Moreover, calcitonin administration up-regulates HB-EGF in uterine of naturally pregnant mice. Also, upregulation of calcitonin receptor was observed in uterin of naturally pregnant and pseudopregnant mice after calcitonin administration.

Key words: Blastocyst, Melatonin, Calcitonin, HB-EGF, Implantation.