استاد راهنما: دکتر محمد انصاری

نگارش:اعظم کارخانه

مقطع دكتري تخصصي بيوشيمي باليني

عنوان پژوهش

تعيين بیان ژن ‌CGRP و ميزان پروتئين‌هاي CGRP و IL-1β، فعالیتiNOS در كشت PBMCs تيمار شده با -17β- استراديول و ملاتونين در بيماران مبتلا به سردردهاي میگرني مطلق قاعدگی

چکیده فارسی

ميگرن شایع­ترین سندرم عصبي-عروقي است که با سردردهاي ضرباني و لرزش­دار، يك­طرفه و شديد مشــــخص مي­شود. شيوع 3 برابری اين بيماري در زنان نسبت به مردان ارتباط آن را با هورمون­های جنسی زنانه مطرح می­کند. افت سريع استروژن خون در اواخر فاز لوتئال و اوايل فاز فوليكولار با تحريك فيبرهاي حسي اعصاب تريژمينال باعث فعاليت فيبرهاي اعصاب حسي تريژمينال اطراف عروق و آزاد سازي پپتيدهاي وازواكتيو نظير  CGRPاز این اعصاب مي‌گردد. اين پپتيد، با تشـدید وازوديلاتاسيون و القای فعالیت آنزیم iNOS و تولید مدیاتورهای التـهابی نظیر IL-1 β باعث التهاب نروژنيك مي‌شود. هدف مطالعه حاضر بررسی اثر ملاتونین به عنوان ماده­ای با خاصیت منقبض کننده عروق و دوز فیزیولوژیک 17β- استرادیول بر بیان ژن CGRP و فعالیت آنزیم iNOS و میزان IL-1β می­باشد.

مواد و روش­ها: این مطالعه بر روی 12 بیمار مبتلا به میگرن مطلق قاعدگی و 12 زن سالم صورت گرفت. سلول تک هسته­ای خون محیطی برای انجام Real time PCR و تعیین فعالیت آنزیم iNOS به مدت 24 ساعت با دوزهای فیزیولوژیک ( M 8-10) و فارماکولوژیک ( M 5-10) 17β- استرادیول و 12 ساعت با دوز فارماکولوژیک ( M 3-10) ملاتونین تیمار شدند. بررسی بیان ژن­های CGRP و –actinβ با روش Quantitative real time PCR، فعالیت آنزیم iNOS و میزان پروتئین­های CGRP وIL-1β به روش الیزا صورت گرفت.

نتایج: در هر دو گروه، تیمار PBMCs با دوز فارماکولوژیک 17β- استرادیول بطور معنی­داری باعث افزایش بیان ژن CGRPشد (05/0>p)، بطوریکه میزان بیان ژن در گروه بیمار و سالم به ترتیب34/1 و 9/1 بـرابـر گردید. تیمـار با دوز فیــزیولـوژیک 17β- اسـترادیـول (71/0Fold change=) و ملاتونین(41/0Fold change=) فقط در گروه بیمار، بطور معنی­داری باعث کاهش بیان ژن CGRPشد (05/0>p). در گروه بیمار، میزان پروتئین CGRP در سوپرناتانت سلول­های تیمار شده با هر دو ماده، بطور معنی­داری کاهش داشت (05/0>p). فعالیت آنزیم iNOS در PBMCs تیمار شده با 17 β- استرادیول تغییری پیدا نکرد، در حالیکه تیمار با ملاتونین باعث کاهش معنی­داری در میزان فعالیت این آنزیم گردید (05/0>p). میزان تولید NO متعاقب تیمار با هر دو ماده بطور معنی­داری کاهش داشت (05/0>p). تیمار با 17β- استرادیول باعث کاهش معنی­داری در تولید IL-1β شد، در حالیکه در تیمار با ملاتونین تغییر معنی­داری نشان نداد.

نتیجه گیری: بیان ژن CGRP و پروتئین آن در اثر تیمار با 17β- استرادیول و ملاتونین کاهش نشان داد. همچنین کاهش تولید NO در سلول­های تیمار شده با 17β- استرادیول و ملاتونین نشان می­دهد که جلوگیری از نوسانات شدید استروژن و یا استفاده از یک ماده منقبض کننده عروق نظیر ملاتونین نقش موثری در مهار بیان ژن CGRP و بهبود وضعیت التهاب دارد. این مطالعه نشان داد که با کاهش بیان ژن CGRP می­توان مدیاتورهای التهابی موثر در التهاب نروژنیک را کاهش داد.

کلید واژه­‌ها: میگرن مطلق قاعدگی، CGRP، iNOS، IL-1β، ملاتونین، 17β- استرادیول

 

Abstract

Background: Migraine is the most common neruo-vascular syndrome that is typified by pulsatile, unilateral, tremulous, and severe headaches. The neuropeptide calcitonin gene-related peptide (CGRP) has long been postulated to play an integral role in the pathophysiology of migraine. In central nervous system, the homeostasis of CGRP is strongly influenced by sex steroids. Since the prevalence of migraine in women is 3 times higher than men, there is a close relationship between migraine and female sex hormones.  Earlier studies reported that CGRP can stimulate the synthesis and release of nitric oxide (NO) and cytokines from trigeminal ganglion glial cells. The goal of this study was to determine the effect of 17β-estradiol and melatonin in regulation of CGRP expression, inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity, NO and Interleukin-1beta (IL-1β) release in cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from pure menstrual migraine patients and healthy subjects.

Methods: This study was performed on twelve pure menstrual migraine patients and twelve age-and sex-matched healthy subjects. PBMCs were isolated and treated with 17β-estradiol for 24 hours at physiological and pharmacological doses. Gene expression was evaluated by real time-PCR. CGRP and IL-1β proteins in culture supernatant were determined by ELISA method. iNOS activity in PBMCs was determined by colorimetric assays. Total nitrite as an indicator of NO concentrations in the culture supernatants was measured using a colorimetric assay. 17β-estradiol treatment had a biphasic effect on expression of CGRP.

Results: We found that 17β-estradiol treatment at pharmacological dose significantly increases mRNA expression of CGRP in both groups, so that the expression of CGRP gene in patient group and healthy subjects was 1.34 and 1.9, respectively. 17 β- estradiol at physiological dose could significantly decreases CGRP mRNA expression(Fold change=0.71), CGRP protein levels, IL-1β release, NO production and iNOS activity only in patient groups.

Also, our results shown that melatonin treatment significantly decreases mRNA expression of CGRP(Fold change=0.4), NO production and iNOS activity only in patient groups.

Conclusion: Collectively, it appears that 17β-estradiol at physiological dose and exogenouse melatonin can exert protective effect on decrease of inflammation in migraine via decrease in levels of CGRP, IL-1β and iNOS activity, however more studies are necessary in this regard.

Key words: Pure menstrual migraine, neurogenic inflammation, CGRP, 17β-estradiol, iNOS, NO.