آموزش تحصیلات تکمیلی علوم پایه دانشکده  

اساتید راهنما:

جناب آقای دکتر محمود قاضی خوانساری

جناب آقای دکتر محمد علی فرامرزی

 نگارنده: علی اکبر یوسفی احمدی پور

کارشناسی ارشد سم شناسی عمومي

عنوان:

بررسی حذف زیستی کتوکونازول با استفاده از کاتالیزور آنزیمی لکاز 

چکيده

کتوکونازول دارویی است که بصورت گسترده برای انسان و دام استفاده می شود اما مقدار باقیمانده ی این ماده ی ضد قارچی دارای پتانسیل ایجاد اثرات مضر بر سلامت اکوسیستم است. مطالعه ی حاضر حذف زیستی و سم زدایی سوبسترای کتوکونازول توسط لکاز را نشان می دهد. سوبسترا در دمای 45 درجه ی سلسیوس، pH معادل 5/4، غلظت 3/0 میلی گرم در میلی لیتر کتوکونازول و فعالیت آنزیمی 1 واحد در میلی لیتر در زمان 6 ساعت به طور کامل حذف شد. با استفاده از 1- هیدروکسی بنزوتریازول به عنوان مدیاتور لکاز با غلظت 1 میلی مولار کارایی حذف افزایش یافت. مطالعه ی سمیت متابولیت های حاصل از تیمار آنزیمی کتوکونازول با استفاده از سودوکرچنریلا ساب کپیتاتا، کاندیدا آلبیکنس، کریپتوکوکوس نئوفورمانس، ساکارومایسس سروزیه انجام گردید که کاهش سمیت را با کاهش مهار رشد به ترتیب 1/25، 7/11، 6/32 و 2/77 درصد نشان می دهد. پارامترهای کینتیکی ثابت میکائیلیس (K_m) و سرعت بیشینه (V_max) حذف کاتالیز شده ی سوبسترا توسط لکاز به ترتیب 099/0 میلی مولار و 43/4 میکرومولار در ساعت در میلی گرم تعیین گردید. همچنین ساختار شیمیایی دو متابولیت هیدروکسیله و N-اکساید کتوکونازول با استفاده از روش های اسپکتروسکوپی شامل ¹³C-NMR، ¹H-NMR، IR و MS تعیین گردید.

واژه‌هاي كليدي:کتوکونازول، لکاز، تیمار آنزیمی، تبدیل زیستی، سم زدایی

Title:

Study on the bioremoval of ketoconazole using the enzymatic catalyst of laccase

Abstract

Ketoconazole is widely used in human and veterinary medicine; however, residual amounts of this antifungal agent have potential adverse effects on ecological health. The present study describes using laccase for bioconversion and detoxification of ketoconazole. The substrate was removed at optimum condition 45 °C, pH 4.5, incubation time 6 h, ketoconazole concentration 0.3 mg ml⁻¹, and laccase activity 1 U ml⁻¹. Using 1-hydroxybenzotriazole (1 mM), a laccase mediator, enhanced the yield of elimination. A microtoxicity study with Pseudokirchneriella subcapitata, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, and Saccharomyces cerevisiae showed a decrease in the toxicity of laccase-treated ketoconazole and isolated metabolites. The kinetic parameters K_m and V_max of laccase-catalyzed removal of the substrate were determined as 0.099 μM and 4.43 μmol h⁻¹ mg⁻¹, respectively. The chemical structure of two major bio-converted metabolites were also identified using spectroscopic methods including ¹³C-NMR, ¹H-NMR, IR and MS.

Keywords: Ketoconazole, Laccase, Enzymatic treatment, Bioconversion, Microtoxicity