اساتید راهنما:

دکتر محمد حسین مدرسی

دکتر مهدی دیانت پور

استاد مشاور: دکتر سید محمد میریونسی

نگارش: زینب جمالی

مقطع كارشناسي ارشد ژنتیک انسانی

 

چکیده فارسی

بررسی میزان پایداری و تغییرات تعداد تکرارهای سه نوکلئوتیدی CAG در ژن HTT به دنبال اسپرماتوژنز در سه مرد ایرانی

مقدمه و هدف مطالعه: لغزش هنگام همانندسازیDNA، نقص در عملکرد آنزیم FEN1، خطا در سیستم تعمیری DNA و همچنین تقسیمات میتوزی متوالی در حین اسپرماتوژنز و به میزان کمتری نوترکیبی میوزی از عواملی هستند که قادرند ناپایداری در توالی های میکروساتلیت را همچنان در طی اسپرماتوژنز القا نمایند. هدف از این مطالعه، سنجش میزان تغییرات تکرار­های نرمال CAG در ژن HTT به عنوان نمونه ای از توالی های میکروساتلیتی، در طی اسپرماتوژنز بود. با استفاده از نتایج چنین مطالعه ای میتوان برآورد صحیح تری از کیفیت انتقال این ناپایداری­ها به نسل بعدی بدست آورد. به علاوه، مطالعه­ی جهش­های ژرم لاین میکروساتلیت­ها، حتی فقط یک کلاس از آنها، این شانس بی سابقه را به ما میدهد تا تغییر و تحول سکانس DNA را با روش مستقیمی دنبال کنیم که در پی آن قادر خواهیم بود به نگرشی جدید در حوزه­ی چگونگی ایجاد و پیشرفت بیماری­های حاصل از ناپایداری تکرارهای سه نوکلئوتیدی، به خصوص در خانواده هایی با جهش های جدید دست یابیم.

 روش انجام کار: پس از دریافت نمونه های خون و مایع منی از سه مرد سالم از نظر ژنتیکی و ابتلا به بیماری هانتینگتون، نمونه DNA از خون افراد استخراج گردید. همچنین سلول های تک اسپرم با استفاده از روش Micromanipulation از هر فرد جداسازی شد. توالی تکراری CAG موجود در اگزون اول ژن HTT (RefSeq NM_002111.7) توسط راه اندازی Nested- PCR بر روی نمونه های DNA خون محیطی و سلول های تک اسپرم تکثیر گردید.  سنجش میزان تغییرات با ران کردن محصول PCR بر روی ژل پلی اکریل آمید غیر واسرشت شونده صورت گرفت.

نتایج: از بررسی مجموع 269 تک اسپرمی که تکثیر آن­ها با موفقیت انجام شد، مشاهده گردید که 3/3%   از آنها دچار تغییر در تعداد تکرارهای CAG  نسبت به DNA خون محیطی گردیده­اند. دو فرد از سه فرد برای این توالی هتروزیگوت بودند که تمامی تغییرات مشاهده شده مربوط به این دوفرد میباشد، در تک اسپرم­های فرد سوم نسبت به DNA خون محیطی وی تغییری مشاهده نگردید.

نتیجه گیری نهایی:  با مشاهده تغییر 3/3 درصدی در توالی تکراری موجود در تک اسپرم ها  میتوان به اهمیت تغییر توالی های نرمال در رسیدن به توالی هایی بزرگتر(Intermediate)   و نهایتا چگونگی شگل گیری توالی های عامل بروز بیماری های حاصل از ناپایداری تکرار ها پی برد.

کلمات کلیدی:  میکروساتلیت؛ اسپرماتوژنز؛ ناپایداری؛ توالی تکراری CAG.

 

 

Abstract

Analysis of stability and changes of CAG trinucleotide repeats in HTT gene following spermatogenesis in three Iranian men.

Microsatellites are among the most variable DNA sequences. Different factors such as slipped-strand mispairing and incomplete performance of FEN1 enzyme are involve in their instability. All of these mechanisms are also stable during gamete production. Numerous mitosis divisions that spermatogonia behind to evolve in primary spermatocyte and the high rate of these divisions, provide conditions that repeats being change. During meiosis another

factor ,recombination, also help to microsatellite instability. We considered normal CAG repeats (14-32 repeats in this study) in HTT gene as a candidates of trinucleotide repeat to investigate whether these repeats can be change during spermatogenesis. So we can explain how repeats get to the threshold of being intermediate alleles and eventually disease causing  length. We examined 269(93+81+95) single sperms from 3 healthy men with nested-PCR followed by polyacrylamide gel electrophoresis and comparing the CAG repeat sizes of  peripheral blood leukocyte DNA with the repeats in single sperms of the same individual . With the use of single sperm analysis as a rapid method, we show that the instability of normal CAG repeat tracts during spermatogenesis is higher than those were reported by some previous studies. The variance of CAG repeat changes between three individuals was significant (F- test p< 0.0001). As we cannot find any changes in single sperms of  the homozygote individual,  Further investigations is needed to study normal repeat instability during spermatogenesis in homozygote individuals, a larger sample size for single sperms can also help to get more comprehensive  results.  

Keywords: Microsatellite, Instability, Spermatogenesis, CAG repeats