آموزش تحصیلات تکمیلی علوم پایه دانشکده  

استاد راهنما:  دکتر نیما رضایی

اساتید مشاور

دکتر فرشید نوربخش

دکتر عباس تفاخری

نگارنده  سارا رشید چهره برق  

مقطع کارشناسی ارشد رشته ایمونولوژی 

عنوان: بررسی میزان لنفوسیت های T تنظیمی و بیان ژن های Foxp3 و IL-2Ra(CD25) در سلول های تک هسته ایی خون محیطی بیماران ALS

چکیده 

مقدمه و هدف: اخیرا بررسی ارتباط بین سیستم عصبی و سیستم ایمنی در پاتوژنز ناهنجاری های نورودجراتیو به عنوان یکی از مباحث مهم مطرح شده است .از انواع آنها می توان به بیماری آمیوتروفیک لترال اسکلروزیس   (ALS[1])اشاره کرد.صرف نظر از مطالعات بسیاری که بر روی مکانیزم های پاتوژنز و عوامل ایجاد کننده آن صورت گرفته،اما هنوز به طور کامل نقش سیستم ایمنی در بیماری ALS به اثبات نرسیده است.به همین علت در حال حاضر درمان موثری برای بیماری ALS یافت نشده است. یکی از ویژگی های بارز در پاتوژنز بسیاری از بیماری های نورودجراتیو مانند پارکینسون، آلزایمر و ALS ، التهاب عصبی مزمن است که در محل آسیب دیده می شود. از سلول های تنظیم کننده پاسخ های ایمنی می توان به لنفوسیت های TCD4+CD25+Foxp3+ اشاره کرد که می توانند نقش در مهار التهاب ایجاد شده داشته باشند.بر همین اساس در مطالعات اخیر ایمنوتراپی با استفاده از لنفوسیت های TCD4+CD25+Foxp3+ یکی از اهداف مهم  محسوب میشود .هدف از مطالعه حاضر بررسی میزان درصد لنفوسیت های T  تنظیمی به عنوان سلولهای تنظیم کننده و اندازگیری بیان ژن های مرتبط با آن مانند ژن IL2Rα و [2]FOXP3 می باشد.زیرا استفاده از این رده سلولی در سلول درمانی و انتقال Passive آنها برای بهبود روش های درمانی در بیماری ALS حائز اهمیت می باشد.

روش کار: مراحل کار شامل جداسازی لنفوسیت ها از سلول های تک هسته ایی خون محیطی، رنگ آمیزی لنفوسیت ها به روش فلوسایتومتری با  استفاده از APC-CD4 anti-Human antibody   PE-CD25 anti-Human antibody, به عنوان مارکرهای سطح سلولی و AlexaFlour 488-FOXP3 anti-Human antibody به عنوان مارکر درون سلولی و فاکتور رونویسی اختصاصی لنفوسیت های T تنظیمی و اندازه گیری درصد لنفوسیت های T تنظیمی و   TCD4+ ،همچنین استخراج RNA و سنتز cDNA از لنفوسیت های خون محیطی و در آخر سنجش بیان ژن های IL2Rα و FOXP3 به روش TaqMan به عنوان ژن های  مورد هدف موجود در لنفوسیت های T تنظیمی با استفاده از پرایمر-پروب های طراحی شده می باشد.

یافته ها و نتیجه ها: نتایج حاصل از رنگ آمیزی لنفوسیت ها در خون محیطی افراد شرکت کننده در مطالعه نشان داد که درصد کل لنفوسیت های T تنظیمی خون محیطی در افراد بیمار نسبت به افراد سالم کمتر است که اختلاف معناداری را به دنبال داشت.در بررسی نتایج حاصل از بیان ژن به روش TaqMan متوجه شدیم که میزان بیان ژن های IL2Rα و FOXP3 علی رغم کاهش در تعداد لنفوسیت های TCD4+CD25+FOXP3+ در افراد بیمار نسبت به افراد سالم بیشتر است  هرچند که این اختلاف معنادار نمی باشد.

بنابراین در این مطالعه میتوان گفت که کاهش درصد لنفوسیت های T تنظیمی می تواند عاملی برای پیش بینی روند رو به رشد بیماری باشد.بر همین اساس این نکته حائز اهمیت است که ایمنوتراپی به روش انتقال Passive لنفوسیت های TCD4+CD25+FOXP3+ می تواند نقش موثری در کنترل التهاب عصبی ایجاد شده و در نهایت درمان بیماری ALS داشته باشد.

کلیدواژه ها: بیماری آمیوتروفیک لترال اسکلروزیس، بیماری های نورودجراتیو، ایمنوتراپی ، التهاب عصبی مزمن،

لنفوسیت های +TCD4+CD25+FOXP3.

Evaluation of regulatory T lymphocytes and also IL2Ra and FOXP3 Genes Expression in peripheral mononuclear cells From ALS patients

Background: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal motor neuron disease (MND) characterized by degenerative changes to upper and lower motor neurons. Patients experience signs and symptoms of progressive

muscle atrophy and weakness, increased fatigue and problems with swallowing, which typically lead to respiratory

failure and death.  The mechanism of the pathology include mitochondrial pathobiology , lactate dyscrasia , immune system alterations and protein aggregation .While the CNS has been known as an immune privileged organ, increasing evidence support the involvement of chronic inflammation in various neurodegenerative disorders including AD, PD and ALS.Alteration in inflammatory cell subtypes is associated with, and maybe driven by, differences in Tregs . Relationships between adaptive immunity and neurodegeneration or neuroprotection were until very recently, less well pursued.

Experimental design: Peripheral blood lymphocyte were separated from peripheral blood mononuclear cells  of 33 healthy donors  and 38 patients with Ficoll density ,after that  we separated 1 million cell for  counting  the TCD4+ lymphocyte cells and regulatory CD4+ T cells with  APC-CD4 anti-human antibody,PE-CD25 anti-human antibody and Alex flour 488-FOXP3 anti-human antibody by Flowcytometry. Residual cells were used  for doing RNA extraction ,Total RNA prepared isolated using RNX-PLUS ,then Approximately 10ng of total RNA from each sample was converted to cDNA using the High Capacity cDNA Reverse Transcription cDNA Synthesis Kit(ABI company) for Single  Tube TaqMan Gene Expression Assays kit(ABI company) ,according to manufacturer’s instructions for doing IL2Ra Gene,FOXp3 Gene and βactine Gene expression .

Result: The result of flow cytometry showed that healthy control`s CD4+ T cells were more than patients despide of that healthy control`s CD4+CD25+FOxp3+ regulatory T cells were less then patients.In addition the result of gene expression assays showed that the expression of IL2Ra  and FOXP3 genes in healthy controls were less than patients.

Conclusion: In this study we recommended using CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells for adaptive immune cell therapy.  increasing the level of CD4+ Tcells in patient  maybe because of increasing the TH17 cells for doing neuroinflammation  in CNS. in addition increasing the level of IL2Ra gene in patients rather than healthy controls in due to increased in the leve of CD4+T cells.

Keywords: Amyotrophic latheral sclerosis ,Neuroinflammation ,Adaptive immune cell therapy, Neurodegeneration ,Neuroprotective ,Regulatory CD4+ T cells