اساتید راهنما  :

دکتر مریم حسینعلی ایزد

دکتر عباس شفیعی

اساتید مشاور :

دکتر محمد حسین نیکنام

دکتر مجید تبیانیان

نگارش  : مریم کشاورز

مقطع ­دکتری­ تخصصی رشته ايمونولوژي

عنوان پژوهشمطالعه­ پايداري ­آنتي­ بادي­ و­ارزيابي­ تعداد­ و­ عملكرد لنفوسيت­هاي­T­و­اندازه ­گيري­ سايتوكاين هاي ­IL10,­IL4, IL12p40­­وIFNγ­­اختصاصي­ ويروس­هاي­ سرخك،­سرخجه ­و­اوريون درافرادي كه در كودكي واكسينه شده اند.

چكيده

بیان مسئله: سال­ها ­ارزیابی واکسن ها ­را­ بر مبنای تیتر آنتی بادی­اختصاصی ­انجام می دادند در­حالی­که­ اهمیت آویدیتی آنتی بادی و همچنین پاسخ ایمنی سلولی ­در دفاع علیه بیماری های ویروسی محرز می­باشد. در­این تحقیق پاسخ ایمنی هومورال و سلولی اختصاصی سرخک، سرخجه و اوریون مورد بررسی قرار گرفت.

روش­ها: ابتدا آنتی ژن های ویروسی تهیه شد، برای این منظور سویه هایEdmonstone, RA27/3  و  RS12بر روی بستر سلول vero کشت داده شد و پس از تیمار با Tween20 و اتر تیتر هماگلوتینین ویروسی­و میزان پروتئین آن اندازه گیری گردید . برای بررسی اثر مهاری ویروس ها بر سیستم ایمنی، سلول های تک هسته ای خون محیطی با آنتی ژن های ویروسی بطور جداگانه کشت شد و رهاسازی سایتوکاین های IL10 و  IL12p40درسوپ محیط کشت بررسی گردید. پاسخ ایمنی هومورال با اندازه گیری تیتر و آویدیتی  IgG  اختصاصی هر ویروس بررسی شد. برای ارزیابی پاسخ ایمنی سلولی فراوانی سلول هایT کشنده یا سازنده IL4 و IFNg درون سلولی توسط لمفوسیت های Th1,Th2 ,CD107a+CD8+ CTL IFNg+ CD8+ T cell اختصاصی ویروس و همچنین پاسخ تکثیر  لمفوسیتی اختصاصی ویروس در  CD4+T cellها و CD8+Tcell ها ­بررسی گردید. براي بررسی و مقايسه داده ها  از آزمون independent samples T test و ضریب همبستگی Pearson استفاده شد.

نتایج:در این مطالعه یک پاسخ سلولی  غالب TH1 اختصاصی ویروس مشاهده شد.  پاسخ های ایمنی سلولی به سرخجه بیشتر از پاسخ ایمنی به ویروس های سرخک و اوریون بود.  فراوانی لمفوسیت های TH2 اختصاصی ویروس های سرخک، سرخجه و اوریون  به ترتیب 1/.±41/0 ، 07/.±37/10 و 17/.±99/0 بود. همچنین فراوانی لمفوسیت های TH1اختصاصی ویروس های سرخک، سرخجه و اوریون  به ترتیب 19/.±97/1 ، 27/.±41/1 و 37/.±72/ اندازه گیری شد. فراوانی لمفوسیت های IFNg+CD8+T و CD107a+CD8+CTL های اختصاصی سرخک به ترتیب 38/.±065/3 و 2/.±82/1 بود؛ فراوانی این لمفوسیت ها برای اوریون 24/.±72/1 و 16/.±05/1  و برای سرخجه 25/.±4/3 و 43/.±08/2 بود.

پاسخ تکثیر لمفوسیتی سلول های CD8+T اختصاصی سرخک، سرخجه و اوریون که بر اساس ضریب تکثیر ارزیابی شده بود به ترتیب 17/.±9/1 ، 11/.±49/1 و 12/.±99/ 1 بود و بر همین مبنا پاسخ تکثیر لمفوسیتی سلول های CD4+T اختصاصی سرخک، سرخجه و اوریون به ترتیب 1/.±69/1، 07/.±41/1 و 178/.±89/1ارزیابی شد.

  اثر مهاری ویروس سرخک (82/1±pg/ml61/10)در محیط کشت که با القای ساخت IL10 توسط سلول های تک هسته ای خون محیطی ارزیابی شد، بیشتر از ویروس های سرخجه(19/2pg/ml 34 /8) و اوریون (29/1 ± pg/ml 73 /4)بود.

در­این مطالعه 7/96% افراد مورد مطالعه نسبت به سرخجه سرم مثبت15Iu/ml15<) بودند، 9/78% از افراد نسبت به سرخک(Iu/ml11<) دارای تیتر آنتی بادی حفاظتی بودند. 4/64% از داوطلبین نسبت به اوریون(5Iu/ml11<) سرم مثبت محسوب می شدند. همه افراد سرم مثبت به سرخجه دارای IgG اختصاصی با آویدیتی بالا بودند(60< AI%). 5/15% افراد سرم مثبت به سرخک(32< AI%) و5/35% افراد سرم مثبت به اوریون(32< AI%) فاقد IgG اختصاصی با آویدیتی بالا بودند. 

علاوه بر این معلوم گردید که 100% افراد (شامل همه افراد سرم مثبت و سرم منفی) دارای پاسخ ایمنی سلولی اختصاصی سرخک و سرخجه می باشند. در مورد ویروس اوریون 100% افراد سرم مثبت و 4/84% افراد سرم منفی دارای پاسخ ایمنی اختصاصی بودند.

نتیجه گیری: درصد افراد سرم مثبت نسبت به سرخجه تقریبا بدون تغییر مانده بود، این در حالی است در مورد سرخک افت مشاهده می شود. میزان تیتر و آویدیتی IgG اختصاصی اوریون کافی نیست. نمی توان پیش بینی و قضاوت درست برای ایمن بودن افراد تنها از روی تیتر IgG اختصاصی داشت. به همین دلیل در بررسی وضعیت ایمنی افراد علاوه بر تیتر IgG اختصاصی ­ویروس­ ، ­ارزیابی پاسخ ایمنی سلولی بویژه در افراد سرم منفی و ارزیابی آویدیتی IgG در افراد سرم مثبت نیز حائز اهمیت است.

کلمات­کلیدی:­ سرخک؛ سرخجه؛ اوریون؛ پاسخ ایمنی سلولی؛ آنتی بادی؛ افینیتی 

Abstract

Study of Durability of Specific Measles, Mumps and Rubella Viruses Antibody, Frequency and Function of T Cells, Measurement of IL-10, IL-4, IL 12p40 and IFNγ Cytokines in Adults who were Vaccinated in Childhood

Back ground: Measles, mumps and rubella are viral infectious diseases that may result in serious complications. Since the production of vaccines, the number of cases of these diseases has been dropped. Nevertheless, these infectious diseases are still one of the major health problems in developing countries. Antigen specific IgG level have been used as gold standard test for evaluation of vaccine efficacy.whereasboth humoral and cellular  immune  responses  are  elicited following  immunization   or natural infection with  measles , mumps or rubella viruses .We want to evaluate the specific humoral and cellular immue responses against measles, mumps and rubella.

Material and methods:  The viral antigens were prepared using Edmonston, RS12, RA 27/3 Strains on vero cell line. Heamagglutinin antiges were assayed using HA test. In this study, the virus specific humoral and cellular immune responses were evaluated among 90 Iranian young adults aged 20-30 years. The suppressor effect of the viruses in peripheral blood mononuclear cells was studied. Specific IgG antibody levels against measles, mumps and rubella and their IgG avidities were measured in plasma using ELISA test. The virus specific memory CD4+ and CD8+ proliferation, frequency of cytotoxic lymphocyte CD8+ CD107a and frequency of IFNg+ CD8+ T, IFNg+ CD4+ T cell and IL4+ CD4+ T cell were studied using flowcytometery. Except for mumps vaccine, all the students had been vaccinated against measles and rubella according to Iran’s nationwide mass vaccination protocol for all persons aged 5–25 in 2003. All statistical analyses were performed with SPSS version 20 software (SPSS, Chicago, USA) or GraphPad Prism v5.0.4.533 software (SPSS, USA) for Windows. We used student’s unpaired T test or Pearson's r for comparison data between groups and considered p values less than 0.05 as significant.

Results: Frequency of measles(1.97±0.19), mumps  ( 1.41±0.27) and rubella( 2.72±0.37) virus specific TH1 lymphocyte were more than of  frequency of measles(0.41±0.1), mumps  ( 0.37±0.07) and rubella( 0.99±0.17 virus specific TH2 lymphocyte. Suppressor effect of measles virus in peripheral blood mononuclear cells was rather than rubella and mumps viruses.  Our results showed that 96.2% of the volunteers had a protective level (>15 IU/ml) of IgG against rubella that all of them had high avidity IgG (AI %> 60%). 79.2% of the volunteers had a protective level (>11 IU/ml) of IgG against measles, but 15.5% of them had low avidity IgG (AI%< 60).  64.16% of the subjects had a protective level (>11 IU/ml) of IgG against mumps, but 35.5% of them had low avidity IgG (AI %<32). All of the volunteers had humolar and cellular immune responses against measles and rubella viruses. 100% of mumps seroposetive subjects had cellular immune responses to mumps virus whereas 84.4% of seronegative subjects had cellular immune responses to mumps virus. There was no relationship between the virus specific homoral and cellular responses.

Conclusion: Over 10 years after Iran's 2003 mass vaccination, the level and avidity of measles specific IgG was decreased. The level and avidity of mumps specific IgG is insufficient. Some of seroposetive subjects had low avidity IgG and some of seronegative subjects had cellular immune responses to measles, mumps or rubella viruses. Therefore, to screen of immunity to measles, mumps and rubella, both humoral and cellular responses could be assayed.

Key Words: measles; mumps; rubella; cellular immune response; antibody; affinity